本发明公开了一种检测过敏原牛奶的试剂盒和引物,具体涉及一组检测过敏原牛奶的引物,其具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.5所示的寡核苷酸序列,及含有这些引物的试剂盒及其检测方法,本发明所述的试剂盒灵敏度高、特异性强、成本低、操作简便。
1.一组检测过敏原牛奶的引物,其特征在于,由序列表SEQxa0IDxa0No.1至序列表SEQxa0IDxa0No.5所示碱基序列的寡核苷酸组成;其中SEQxa0IDxa0No.1为外侧上游引物,SEQIDxa0No.2为外侧下游引物,SEQxa0IDxa0No.3为内侧上游引物,SEQxa0IDxa0No.4为内侧下游引物,SEQxa0IDxa0No.5为环状下游引物。
2.一种检测过敏原牛奶的试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括以下试剂:(1)LAMP反应液,其包括:ThermoPol缓冲液、甜菜碱、dNTPs、MgSO₄和检测引物;(2)Bstxa0DNA聚合酶;(3)DEPC水;(4)阴性对照;(5)阳性对照;(6)显色液:SYBRxa0Greenxa0I染料。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述检测引物为序列表SEQxa0IDxa0No.1所示的外侧上游引物,序列表SEQxa0IDxa0No.2所示的外侧下游引物,序列表SEQxa0IDxa0No.3所示的内侧上游引物,序列表SEQxa0IDxa0No.4所示的内侧下游引物,序列表SEQxa0IDxa0No.5所示的环状下游引物。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒,其特征在于,所述LAMP反应液中各种成分的使用终浓度为1×ThermoPol缓冲液、0.8M甜菜碱、1.4mMxa0dNTPs、4.0mMxa0MgSO₄、0.2μM外侧上游引物、0.2μM外侧下游引物、1.6μM内侧上游引物、1.6μM内侧下游引物、
0.8μM环状下游引物。
5.一种检测过敏原牛奶的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:1)提取样品的DNA;2)进行LAMP反应;反应条件为63°C恒温反应60min,85°C2min使酶失活,反应结束;3)通过反应体系颜色变化和/或电泳检测进行结果判定;其中,进行LAMP反应时,使用的引物为序列表SEQxa0IDxa0No.1所示的外侧上游引物,序列表SEQxa0IDxa0No.2所示的外侧下游引物,序列表SEQxa0IDxa0No.3所示的内侧上游引物,序列表SEQxa0IDxa0No.4所示的内侧下游引物,序列表SEQxa0IDxa0No.5所示的环状下游引物。技术领域
本发明涉及一种检测过敏原牛奶的试剂盒和引物,属生物技术领域。
背景技术
食物过敏已成为重要的食品安全问题。过敏性疾病发病率呈逐年上升趋势。据文献报道40%的小孩被诊断出在某种程度上患有过敏性疾病,1990~2000年在英国和爱尔兰已有8人死于此病。食物过敏目前只能预防,不可治愈。为了维护易过敏消费者的利益,美国和欧盟制定了食品致敏原标签法规,法规要求生产企业明确标明其产品中是否含有8大类和12种主要的食品致敏原,乳及乳制品是FAO/WHO认定的导致人类食物过敏的八大类食品之一,作为婴儿和儿童的主要食品及成人餐饮主要构成部分的牛奶与奶制品的质量和安全备受关注。由于婴儿和儿童的耐受力有限,过敏一旦发生结果往往比较严重。甚至会导致儿童过敏性死亡,调查发现牛奶及其制品引发的儿童过敏发生率高达7.5%,因此牛奶也是美国及欧盟新食品标签法中规定必须标示的过敏原成分之一,而中国食品出口企业常因食品过敏原标注不正确而被美国FDA通报且遭遇退货。国内的过敏原研究尚处在起步阶段。本研究尝试在国内研制出高灵敏、高特异的牛奶过敏原成分lamp检测试剂盒.以满足我国进出口食品贸易的需求.同时为制定我国食品过敏原标签管理奠定了技术基础目前普遍应用基于DNA的检测技术对过敏原牛奶进行检测。用于检测牛乳过敏原的方法有多种:免疫吸附实验(ra—dio—allergosorbentxa0test,RAST)、高压液相层析法(high—pressurexa0liquidxa0chromatography,HPLC)、SDS—PAGE电泳、酶联免疫吸附实验(enzyme—linkedxa0immunosorbentxa0assay,ELISA)等:但是加工对牛乳中过敏原成分会产生一定的影响,比如一些热处理,会对牛奶的过敏原成分,主要是一些蛋白类物质产生影响,从而影响检测,而且,这些方法需要对操作技术有一定的要求,检测周期长。而环介导的等温扩增技术Loop-MediatedIsothermalxa0Amplification,LAMP)依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶,在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增靶序列,因此不需要PCR仪。由此建立基于LAMP扩增技术的过敏原牛奶检测方法并开发了相应的检测试剂盒,具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测过敏原牛奶的LAMP引物。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种操作简单、结果准确的检测过敏原牛奶的试剂盒。为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:本发明提供了一组检测过敏原牛奶的引物,该组引物是依据NCBI收录号NC_006853.1对应的基因序列设计的,由序列表SEQxa0IDxa0No.1至序列表SEQxa0IDxa0No.5所示碱基序列的寡核苷酸组成;其中SEQxa0IDxa0No.1为外侧上游引物,SEQxa0IDxa0No.2为外侧下游引物,SEQxa0IDxa0No.3为内侧上游引物,SEQxa0IDxa0No.4为内侧下游引物,SEQxa0IDNo.5为环状下游引物。详见表1。表1引物序列ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>本发明所提供的引物具有以下优点:(1)高效灵敏。近年来的研究显示引入环状引物将有助于提高检测灵敏度,缩短反应时间。(2)特异性强。本发明提供一种检测过敏原牛奶的试剂盒,包括以下试剂:(1)LAMP反应液,其包括:ThermoPol缓冲液、甜菜碱、dNTPs、MgSO₄、外侧上游引物(F3)、外侧下游引物(B3)、内侧上游引物(FIP)、内侧下游引物(BIP)、环状下游引物(LB);其中,外侧上游引物(F3)是序列表SEQxa0IDxa0No.1所示的核苷酸序列,外侧下游引物(B3)是序列表SEQxa0IDxa0No.2所示的核苷酸序列,内侧上游引物(FIP)是序列表SEQIDxa0No.3所示的核苷酸序列,内侧下游引物(BIP)是序列表SEQxa0IDxa0No.4所示的核苷酸序列,环状下游引物(LB)是序列表SEQxa0IDxa0No.5所示的核苷酸序列;引物委托大连宝生物工程有限公司合成;(2)Bstxa0DNA聚合酶:8U/μL,购自NEB公司;(3)DEPC水;(4)阴性对照:DEPC水;(5)阳性对照:由市售欧德堡超高温处理全脂纯牛奶(德国)提取的核酸作为阳性对照;(6)显色液:SYBRxa0Greenxa0I染料,购自Invitrogen公司。其中所述LAMP反应液中:ThermoPol缓冲液,购自NEB公司,1×ThermoPol缓冲液含0.1%TritonX-100、10mM(NH4)₂SO₄、10mMxa0KCl、20mMxa0Tris-HCl(pH8.8);甜菜碱:购自Sigma公司;dNTPs:购自天根。本发明还提供了一种检测过敏原牛奶的方法,该方法包括以下步骤:(1)提取样品的DNA,即模板DNA,可以利用现有技术中已知的方法或试剂盒提取,例如采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒或等效试剂盒,或者CTAB方法提取样品基因组DNA;(2)进行LAMP反应,该LAMP反应体系见下表:表2LAMP反应体系ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>(3)反应条件:63°C恒温反应60min,85°C加热2min使酶失活,反应即结束;(4)结果判定:颜色变化:向反应终体系加入1μl显色液即SYBRxa0Greenxa0I荧光染料,阳性反应呈荧光绿色,而阴性反应则保持SYBRxa0Greenxa0I染料的荧光橙色。电泳检测:LAMP法的扩增产物是各种不同长度的茎—环状结构DNA,因此阳性反应通过1.5%琼脂糖电泳检测呈梯形条带,而阴性反应则没有梯形扩增条带出现。本发明的优点是:本发明设计6条引物对靶序列的6个特异序列区的识别,保证了LAMP扩增的高度特异性。即LAMP能从仅相差1个核苷酸的基因标本中,找出相应的靶序列进行扩增。并且本发明在等温条件下扩增,不会因温度改变而造成时间的损失,而且受非靶序列的影响小。同时耗时短,在1h内可将靶序列扩增至10⁹倍。下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明,凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换,均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1LAMP检测灵敏度图;(其中M:分子量标准,DL2000;1,过敏原牛奶阳性对照;2-5,过敏原牛奶阳性对照倍比稀释后扩增结果(10^-1-10^-4)),NC为阴性对照。)图2荧光PCR检测灵敏度图;(从左到右,依次为阳性对照、过敏原牛奶阳性对照倍比稀释后扩增结果(10^-1-10^-4))图3LAMP检测的特异性分析图;其中,1:纯牛奶;2:牛奶奶粉;3:牛奶冰激凌;4:酸牛奶;5:牛奶饼干;6:牛奶奶酪;7:山羊奶;8:山羊奶粉;9山羊奶酪;M:DL2000;NC:阴性对照
具体实施方式
实施例1:LAMP检测体系的建立与优化1.方法:1)Mg²⁺浓度:按照表2的反应体系配制反应混合液,分别调节Mg2+浓度至2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、12mmol/L,于65°C保温60min后,85°C反应2min终止反应。比较不同Mg²⁺浓度对扩增效率的影响。2)dNTPs浓度:按照表2的反应体系配制反应混合液,分别调节dNTP终浓度至0.6mmol/L、1.0mmol/L、1.4mmol/L、1.6mmol/L、1.8mmol/L、2.0mmol/L、2.2mmol/L,于65°C保温60min后,85°C反应2min终止反应。比较不同浓度dNTP对扩增效率的影响。3)甜菜碱浓度:按照表2的反应体系配制反应混合液,并调节甜菜碱浓度至0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L、1.0mol/L、1.2mol/L,于65°C保温60min后,85°C反应2min终止反应。比较不同浓度甜菜碱对扩增效率的影响。4)反应温度:按照表2的反应体系配制反应混合液,分别于61°C、63°C、65°C、67°C保温60min后,85°C反应2min终止反应。比较不同反应温度对扩增效果的影响。5)反应时间:按照表2的反应体系配制反应混合液,分别于63°C保温10min、15min、25min、45min、60min,85°C反应2min终止反应。比较反应时间长短对扩增效果的影响。2.结果:进行2%琼脂糖凝胶电泳检测,结果发现Mg²⁺浓度选用4mM、dNTPs浓度选用1.4mM、甜菜碱浓度为0.8M、于63°C反应60min时所得扩增效果最佳,故以此做为试剂盒组成的依据和推荐反应条件。实施例2:检测过敏原牛奶的试剂盒的组成一、试剂盒的组成(保存于-20°C)(1)LAMP反应液,其包括:ThermoPol缓冲液、甜菜碱、dNTPs、MgSO4、外侧上游引物(F3)、外侧下游引物(B3)、内侧上游引物(FIP)、内侧下游引物(BIP)、环状下游引物(LF);其中外侧上游引物(F3)是序列表SEQxa0IDxa0No.1所示的核苷酸序列,外侧下游引物(B3)是序列表SEQxa0IDxa0No.2所示的核苷酸序列,内侧上游引物(FIP)是序列表SEQxa0IDNo.3所示的核苷酸序列,内侧下游引物(BIP)是序列表SEQxa0IDxa0No.4所示的核苷酸序列,环状下游引物(LF)是序列表SEQxa0IDxa0No.5所示的核苷酸序列;引物委托大连宝生物工程有限公司合成;(2)Bstxa0DNA聚合酶:8U/μL,购自NEB公司;(3)DEPC水;(4)阴性对照:DEPC水(5)阳性对照:由市售欧德堡超高温处理全脂纯牛奶(德国)提取的核酸作为阳性对照,采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒并按其操作说明提取1mL样品基因组DNA,核酸浓度约为60ug/ml;(6)显色液:SYBRxa0Greenxa0I染料,购自Invitrogen公司。其中所述LAMP反应液中:ThermoPol缓冲液,购自NEB公司,1×ThermoPol缓冲液含0.1%TritonX-100、10mM(NH4)₂SO₄、10mMxa0KCl、20mMxa0Tris-HCl(pH8.8),甜菜碱:购自Sigma公司,dNTPs:购自天根。实施例3:检测过敏原牛奶的试剂盒的特异性和灵敏性试验1.检测灵敏度分析对过敏原牛奶阳性对照DNA溶液进行10倍梯度稀释,分别进行LAMP和荧光PCR检测。结果发现LAMP可检测到10^-3(图1),实时荧光PCR检测可检测到10^-4(图2)。LAMP反应体系及反应条件如上所述。25μL的实时荧光RT-PCR反应体系包括:2×Masterxa0mix(ABI公司,货号1110131)12.5μL、10μmol/L上游引物(5"-CCTATACTTTCTCCTCATCCTAGTGCTAAT-3",序列表中的编号为SEQxa0IDxa0No.6)和下游引物(5"-CCTGTCTTCATTTTAGTAATTTGTTTTCG-3",序列表中的编号为SEQxa0IDxa0No.7)各1μL、10μmol/L探针(5"-FAM-CCAACGGCCGGCAC–TAMRA-3",序列表中的编号为SEQxa0IDxa0No.8)0.5μL以及DNA模板3μL。于ABI7900PCR仪中按以下条件进行反应:50°C2min,95°C10min;95°C15s,60°C1min,40个循环。2.检测特异性分析表3实验用样品列表序号
样品名称
1
:纯牛奶
2
牛奶奶粉
3
牛奶冰激凌
4
酸牛奶
5
牛奶饼干
6
牛奶奶酪
7
山羊奶
8
山羊奶粉
9
山羊奶酪
对表2中所列实验样品DNA分别进行LAMP扩增检测,结果显示1-6(含牛奶成分的样品)的扩增产物经SYBRxa0Greenxa0I染色显荧光绿色,经琼脂糖凝胶电泳检测则出现典型的梯状扩增带;而其余实验样品均无特异性扩增(见图3),无任何假阳性和假阴性结果出现,说明该方法检测过敏原牛奶具有良好的特异性。显然,本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="457"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="457"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>